JBJS综述：细菌学培养阴性的关节假体周围感染

要点：

1. 1.细菌学培养阴性的关节假体周围感染目前仍是临床诊断的难点。

2. 2.怀疑假体感染的关节内分离感染病原体失败的原因很多，其中一个重要的原因是在获取假体感染的细菌培养物之前使用了抗生素治疗。

3. 3.对怀疑假体周围关节感染的患者，在确切诊断假体感染前应当避免使用抗生素，或者在停用抗生素2周后对关节穿刺获取穿刺液进行细菌培养。

4. 4.其他可以提高细菌培养阳性检测率的方法包括获取培养后将培养物快速转运至检测部门，将获取的组织培养物放置在合适的介质内，对假体进行超声裂解以获取假体上可能存在的细菌，延长细菌培养周期至2-3周。

5. 5.对怀疑关节假体周围感染但早先关节穿刺培养未获取阳性结果的患者，其处置措施和阳性患者基本相同，在进行手术翻修时需获取至少3-5个组织培养标本。

6. 6.生物学和分子学技术，如PCR等未来可以为关节假体感染的病原学诊断提供极大的参考价值。

关节假体周围感染（periprosthetic joint infection，PJI）是关节置换术后最为灾难性的并发症。尽管文献报道美国PJI的发生率仅在1-2%之间，但PJI是目前医疗保险人群膝关节置换术后翻修的首要因素，同时也是目前髋关节置换术后翻修的第三大原因。此外，关节假体周围感染的发生率呈现上升趋势，据估计到2020年，美国关节置换患者年PJI发生率可达到6万-7万人。

诊断关节假体周围感染需结合患者病史，体格检查结果，实验室及影像学检测结果。从可疑感染关节部位获取的体液或组织细菌培养结果可以指导临床上的抗生素选择，并帮助预测患者PJI后的功能预后。据美国骨骼肌肉感染协会发布的指南标准，PJI的定义为：从怀疑假体感染的同一假体关节内获取的体液或组织，至少有两个或以上的标本培养出同一类型的细菌。在临床实践中，有7-12%的患者，尽管有PJI的临床表现，实验室和影像学检测结果也提示PJI，但是其细菌培养结果阴性，这类患者是PJI临床诊断和治疗的难点。

细菌培养的假阴性结果不仅影响临床中抗生素的使用，而且因诊断不明确，可能会对患者和医生造成困扰。治疗细菌培养结果阴性的PJI的策略是针对假体感染最为常见的细菌应用广谱或联合使用抗菌素。但这样的治疗措施带来的后果是：抗生素的副作用增加；常规的抗生素并不能覆盖真菌或少见细菌感染；在某些情况下可能诱导细菌的抗生素耐药性。因此，采取合理的方法尽可能的获取PJI感染病原体信息对临床诊断和治疗非常重要。

PJI细菌培养阴性的原因

文献报道PJI细菌培养阴性的概率在7-12%之间。早先研究发现了和细菌培养阴性相关的多个潜在因素，其中最为重要的因素是在获取感染关节内的细菌培养的标本或组织之前就使用了抗生素。Trampuz等人发现，无论使用何种抗生素，在抗生素停用2周内进行的细菌培养的阳性率较低。Berbari等人在对60例细菌培养阴性的PJI患者的研究中发现53%的患者在进行细菌培养前已经接受抗生素治疗。若患者感染状况允许，则推荐在停用抗生素2周和获取细菌培养的标本，该方法可提高细菌培养阳性检出率；对部分生存条件较为苛刻的细菌，延长抗生素停用的周期可以提高检出率。

此外，在获取培养和关节滑囊液前使用抗生素治疗可以影响关节滑囊液的白细胞计数和分类，而白细胞计数对诊断PJI非常重要。同时，研究发现，关节置换术后的引流留置时间较长也会降低后期细菌培养的阳性率，这可能和留置引流管会相应延长临床使用抗生素的时间相关。

细菌培养技术也可能影响细菌培养的结果。

PJI假体感染的细菌培养结果阴性另外一个可能的原因是传统的细菌培养方法并不能检测包被在生物膜内的感染病原体。假体感染时，病原体包被在由大分子（多糖蛋白质复合物）组成的复杂生物膜内，可以逃避宿主的免疫系统监测。研究者估计，这一包被的病原体对抗生素的抵抗力较蜉蝣行的病原菌高1000倍以上。在慢性PJI中，大部分的病原微生物均存在于生物膜中，并附着与假体表面和周围组织，而病原菌的培养依赖单独浮游病原菌，这也是PJI患者感染培养检出率较低和血液中炎症感染指标升高不多的原因。

PJI诊断时的细菌培养基种类和分离方法等也会显著影响培养的结果。非典型的病原菌，如真菌，分支杆菌在常规的厌氧或需氧培养基中并不能很好的生长，而疮疱丙酸杆菌和其他一些凝固酶阴性的葡萄球菌培养分离时间需要1-2周。

细菌培养组织标本获取的方法和转移至实验室的过程也可能影响培养结果。从关节内非感染部位获取的组织标本，转移标本过程的延迟使得标本脱水，转移过程中将标本暴露于极端的温度中等均可能造成培养结果的假阴性。

细菌培养穿刺液获取的过程也可能影响检测结果。在获取穿刺液时，通常在关节内注射局部麻醉药物以减少患者的疼痛，但是局麻类药物可能会影响细菌增殖。术中使用抗菌物冲洗感染关节获取的液体培养标本也会降低细菌培养阳性的概率。

细菌培养阴性患者提高细菌确诊率的策略

AAOS关于膝、髋关节PJI诊断和治疗的临床指南中强烈建议，对怀疑可能存在PJI的患者，在获取确定性的诊断之前不使用抗生素。和早前的报道类似，该策略是降低PJI诊断时细菌培养结果假阴性率的最为有效的方法。该指南同时建议，对已经采用抗生素治疗的怀疑PJI的患者，停用抗生素2周后再行细菌学培养，而对部分培养较为困难的细菌，可以适当延长停用抗生素的时间。

翻修手术术前使用抗生素存在两种情况，一个是治疗应用，一个是预防性应用。据现有的研究资料，在翻修手术获取深层的软组织标本前并不推荐治疗性使用抗生素，但在翻修术前预防性使用抗生素是否会影响细菌检出率目前仍存在较多争议。首次关节置换术前常规预防性使用抗生素是目前公认的降低术后PJI感染的一项措施，传统观点认为，对翻修的关节置换术，术前预防性使用抗生素可能会影响深部组织的细菌检出率。但是，近期的两项研究对这个观点提出了挑战。Chanem和Burnett等人的研究发现，翻修术前单次预防性使用抗生素并不会显著影响细菌的检出率。

此外，随着“诊断”或“排除”细菌感染的检测技术进步，翻修术前不预防性使用抗生素的观点已经开始有所改变。美国AAOS协会的PJI诊断临床指南推荐所有关节翻修术前均进行ESR和CRP检测，该两个指标可以较为敏感的反应感染状况。若血清学检测结果阴性，诊断PJI的可能性较低，不预防使用抗生素所可能产生的危险性比预防性使用抗生素而带来细菌培养结果阴性的危险性要高，此时推荐预防性使用抗生素。

与此类似，若ESR及CRP水平升高，或者临床诊断PJI的可能性很高，则推荐在术前行关节穿刺和滑膜液WBC分类和计数，以确定或排除感染诊断。此外，关节液的细菌培养也可确诊PJI的病原菌。因此，对关节假体无菌性坏死翻修和术前已经确诊假体感染的患者，翻修手术前应当预防性使用抗生素；而对高度怀疑PJI，但翻修术前并没有获得相应的病原菌依据的患者，术前预防性使用抗生素应当慎重。

AAOS指南推荐，PJI假体翻修术时应当获取感染关节内多个软组织标本进行细菌学培养。从假体髓腔内或骨-假体界面获取的组织标本细菌检出率更高，而直接使用关节滑囊液或者组织比使用棉签获取的培养标本检出率更高。在获取组织标本时应使用尖刀割取，而不是电刀烧取，因电刀在切割组织的过程中产生巨大热量，容易导致组织坏死，干扰病原菌的分离。获取的组织标本应当使用干净的器械夹取，并直接转移入培养容器中，而不能与手套或铺巾接触，该原则可以减少假阳性的发生率，确保细菌培养标本培养出的细菌来源于关节内。

PJI细菌培养有特殊的技术。获取的培养标本或关节液应当立即进行转移。使用血培养基可以改善病原微生物的检出率，减少其他培养基潜在的污染几率。关节液在血培养基内的细菌检出率更高，诊断的特异性和敏感性更好。若怀疑是真菌或分支杆菌感染，则需使用Amies或者Stuart转移中介物，并使用特殊的分离培养基（Lowenstein-Jensen 生长基, Sabouraud 琼脂, or brain-heart融合琼脂）。

另一个提高细菌检出率的方法是延长细菌培养的时间至14天或21天。PJI细菌培养基在实验室中保存的时间应当在14天左右，在某些极端情况下，可延长至21天。细菌可按照分离时间点分为两类：早分离型菌落，在培养的7天内就可分离出的细菌；晚分离型菌落，在培养的第二周内分离出的菌落。尽管目前有些组织推荐所有的细菌培养标本的培养时间均应达到14天，我们推荐，只有在经过规范培养方案后细菌培养结果仍为阴性的标本需要将时间延长至14天。

假体超声裂解可以破坏假体表面的生物膜，暴露病原菌，提高培养检出率。超声裂解可以提高颗粒化学降解率，同时破坏细菌壁，并改变细菌壁的通透性，但同时又能保存病原菌的活性。超声裂解翻修后回收的假体后的细菌培养结果阳性率好于常规培养方法，其潜在的优势包括：方法应用较简便，可重复性好，可提高病原菌分离率；其缺点是临床使用的有效性未经大样本研究证实。

感染病原菌分离新的分子生物学技术

近些年，分子生物学技术飞速发展。感染的特异性较高的生物标志物成倍出现。近期白血球酯酶带技术已经应用与临床诊断中，其诊断PJI具有100%的特异性和敏感性。该检测方法简单，经济，但在使用时容易被关节内的血或其他关节液污染，导致辨读困难。

PCR技术通过检测DNA也可以用于PJI的诊断，但是受限于技术条件，假阳性率，高额花费等，目前其在临床中的应用并不多。

2014年3月11日在美国新奥尔良召开的AAOS会议上，多个学者报道了PJI诊断潜在血清标志物，如Toll样受体，防御素α，中性粒细胞弹性蛋白酶2，杀菌/透性增加蛋白，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，乳铁传递蛋白等在临床中联合应用，具有较为可靠的敏感性和特异性，是未来PJI诊断的发展方向（AAOS：生物标志物诊断假体周围感染的时代已经来临）。

细菌培养假阳性

本文重点介绍细菌培养结果假阴性，但PJI细菌培养结果假阳性同样非常重要。即便被称之为诊断金标准，传统的细菌培养方法也有较多的局限性。为减少细菌培养结果的假阳性率需注意在获取组织标本及培养过程中保持标本的相对无菌状态。

需要特别注意的是，对细菌培养结果阳性的患者，需同时综合考虑其他诊断依据。美国AAOS PJI诊断指南推荐，在进行翻修术前，应当获取患者的血清学指标，若血清学指标正常，则获取关节积液标本，并尽可能在术前即确诊是否存在PJI。特别的，当ESR和CRP水平均正常，患者PJI的可能性就较低，若患者的关节液培养结果阳性，此时需怀疑是否存在假阳性可能。

此外，若患者的血清学检测结果异常，术前已进行关节积液穿刺WBC检测和细菌培养，若关节液WBC计数和分类正常，细菌培养结果阴性，则PJI可能性较小。假体周围组织的组织病理学检测是诊断PJI感染另一个较为有用的工具，可以帮助临床医生确定培养结果是否存在假阳性可能。AAOS指南推荐，在术中应当获取多个软组织标本，3-5个软组织标本可以改善培养结果的可靠性。最后，若对PJI诊断假阳性存在疑问，可寻找感染科医生帮助。

怀疑PJI细菌学培养阴性患者的临床诊断和治疗策略

当临床医生遭遇病史，体检，血清学和影像学检测均提示PJI可能，但细菌培养结果阴性的病例时，可以遵循以下的治疗原则进行处置。

第一，重复进行关节腔积液穿刺，在进行重复穿刺前，确保患者停止抗生素使用达到2周。获取的关节液标本应进行厌氧菌、需氧菌、真菌、抗酸杆菌检测和培养，培养基同时应当包括血培养基。获取的组织液标本应当立即送往细菌室。临床医生应当和细菌室检验员进行沟通，确定可能是何种细菌，需要何种培养方法。最后，需详细询问患者的既往病史，以确定或除外是否有感染非典型病原体的可能。若上述措施皆已采取，但细菌培养结果仍为阴性，此时应当邀请感染科医生进行会诊。

在细菌学培养阴性患者的翻修手术时，应当在怀疑最可能感染部位获取3-5块软组织标本进行培养。培养策略同上。若有超声裂解技术，则推荐对回收的假体进行超声裂解，以提高细菌检出率。在进行组织培养的同时，应当获取5个最可能感染部位的软组织标本进行组织病理学检测，以协助后期的感染诊断。

总之，细菌学培养阴性的高度怀疑PJI诊断的患者对骨科临床医生是一个重要的挑战。因不能准确获取感染病原菌，对这类患者直接使用病原菌敏感的抗生素并无可能，因此在临床治疗中需要光谱及联合使用抗生素，而上述方法则会增加药物副作用，诱导细菌耐药性。细菌分离结果阴性的原因很多，最为重要的原因是在获取病原菌培养标本之前即使用了抗生素治疗。其他可能的原因包括：生物膜包被细菌结构，培养非典型的病原菌时未使用特殊的培养基。AAOS临床PJI诊断和治疗指南建议，对怀疑PJI诊断的患者，在未明确诊断或除外感染之前不优先考虑使用抗生素。在停用抗生素2周后再次进行细菌培养可以提高检出率。

对细菌学检测阴性，而高度怀疑PJI，炎症指标升高的患者，推荐再次进行关节穿刺检测。提高细菌检测阳性率的方法较多：细菌培养标本的快速转运，在相对无菌的坏境下操作，将获取的标本放置与合理的培养基内，延长细菌培养和分离的时间，对非典型病原菌使用特别的培养基。