摘要：目的探讨环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对人肝癌SMMC-772l细胞侵袭转移能力的影响，为塞来昔布在临床上治疗肝肿瘤提供理论依据。方法应用体外细胞培养技术培养人肝癌细胞株SMMC-7721，并以重建基底膜的侵袭试验、趋化运动试验、对层粘连蛋白的粘附试验以及损伤刮擦实验观察不同浓度塞来昔布对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭、转移能力的影响。结果塞来昔布作用于人肝癌SMMC-7721细胞后，其细胞黏附率明显下降，而运动抑制率及侵袭抑制率明显上升，与对照组相比差别均有统计学意义，且塞来昔布浓度与肿瘤细胞黏附率，运动抑制率及侵袭抑制率均有相关性。结论环氧合酶-2抑制剂塞来昔布能明显抑制人肝癌SMMC-7721细胞的黏附、运动及侵袭能力，故可阻抑肝癌细胞的转移，可能是预防肝癌复发的重要候选药物之一。
肝癌的侵袭转移是导致肝癌患者病情复发和死亡的主要原因。积极探索阻断肝癌侵袭转移的有效途径，成为大幅度降低其死亡率的当务之急。随着环氧合酶-2(COX-2)在肿瘤发生中重要地位的确认，COX-2抑制剂能否用于临床治疗肝癌正逐渐成为研究的焦点。本研究以体外培养的人肝癌细胞株SMMC一7721为对象。观察COX-2抑制剂塞来昔布对人肝癌SMMC一7721细胞侵袭能力的影响。评价塞来昔布用于临床肝癌治疗的可能性。为其临床应用提供理论基础和方法学依据。
1 材料和方法
1.1材料
人肝癌细胞株SMMC一7721、NIH／3T3细胞株由本实验室保存，塞来昔布为辉瑞公司产品，Boyden小室购自Millipore公司。培养液GIBCORRL公司产品，胎牛血清杭州四季青生物公司产品，酶标仪BIORAD公司产品。Matrigel(人工基底膜胶)购自BD公司
1.2细胞培养和药品配制
人肝癌SMMC-7721细胞株，体外传代培养，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48 h，每24 h换培养液1次。待培养瓶底铺满肝癌细胞后，弃去培养液，用0.25％胰蛋白酶消化SMMC-772l肝癌细胞，含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为lxl06／ml。取对数生长期细胞用于实验。将塞来昔布溶于灭菌的DMSO，塞来昔布储存液浓度分别为20、60、100μmol/L，的工作液，设0μmol/L为对照。
1．3 SMMC-7721细胞与刚的黏附实验
以每孔50 μg/mL FN溶液40μl包被96孔细胞培养板。4℃下避光过夜。取lxl06/ml的SMMC-7721人肝癌细胞接种于已包被FN的96孔培养板中。每孔100μl，设5个复孔。实验组将塞来昔布浓度为20、60、100μmol/L 3个剂量组加人，不加塞来昔布为对照组，以培养液代替SMMC-7721细胞设为空白对照组。置于37℃、5％CO2饱和湿度下的培养箱内孵育2 h。终止处理后，PBS溶液冲洗两遍，加入100μl/孔0．5％结晶紫染液，染色10min。PBS溶液冲洗4次，37℃干燥，每孔加入1％醋酸乙醇100μl，混匀后静置10 min。在酶联仪波长570nm波长处测出各孔吸光度值(OD)，按下列公式计算细胞黏附抑制率：抑制率(％)=1-(实验组OD-空白对照组OD)/(对照组OD-空白对照组OD)x100％。
1．4细胞的迁移实验(损伤刮擦实验)
将对数生长期SMMC-7721人肝癌细胞接种于12孔培养板中，形成细胞单层。用移液器滴头沿培养板底部呈“一”字形划痕单层培养细胞,镜下记录划痕区相对距离，更换体积分数为1％胎牛血清的RPMI1640培养液,培养24 h更换体积分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养48h，观察并照相。每组平行4个样本。实验重复3次。
1．5细胞侵袭实验
参照Albini等[2]所用方法，将作为化学趋化物的NIH3T3细胞培养上清液0.2 ml加入Boyden小室的下室，在上下室之间用孔径8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开，该膜预先铺上Madrigel溶液40μl(含Matrigel 120μg)，并在37℃聚合30 min以重建基底膜。将含浓度分别为20、60、100μmol/L的细胞悬液200μl加到Boyden上室中，在37℃、5％C02培养箱孵育6 h后取出滤膜，擦尽膜上Matrigel及未穿过的细胞。甲醇固定1min，HE染色。200倍光学显微镜下随机记数5个视野穿过聚碳酸酯膜的细胞数，取均值，结果以抑制率表示。设不加塞来昔布为对照组，每组设5个平行Boyden小塞。抑制率=[(对照组穿膜细胞数-实验组穿膜细胞数)／对照组穿膜细胞数]x100％。
1．6细胞体外运动实验
聚碳酸酯微孔滤膜预先不铺上Madrigel溶液，其余同细胞体外侵袭实验。
1．7统计学处理
所有数值均以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2．1塞来昔布对SMMC-7721与FN黏附的影响(表1)
表1 塞来昔布对SMMC-7721细胞与FN黏附抑制率的影响（%）
*表示各实验组间比较P<0.05
人肝癌细胞SMMC-7721与纤连蛋白之间黏附力强，塞来昔布作用2 h后。细胞黏附能力明显下降。各剂量组与对照组相比较，差异均有显著性(p<0.05)。不同剂量组间相比较，亦有显著性差异(p<0.05)。
2．2塞来昔布对SMMC-7721细胞迁移的影响
损伤刮擦实验显示，对照组细胞划痕区72 h着有大量细胞进入，而塞来昔布组的细胞迁移却不明显(图1)，提示塞来昔布对肝癌细胞的迁移有明显的抑制作用。
图1 损伤刮擦实验检测细胞迁移能力
A：对照组；B：塞来昔布处理组
2．3塞来昔布对SMMC-7721细胞侵袭、运动能力的影响(表2)
实验各剂量组与对照组对细胞侵袭、运动能力的影响比较，细胞侵袭、运动个数及抑制率差异具有显著性意义(P<0.05)；实验各剂量组组间相比较，差异具密显著性意义(P<0.05)，提示塞来昔布对SMMC-7721细胞侵袭抑制率及运动抑制率与浓度呈依赖关系。
*表示各实验组间比较及实验组与对照组比较P <0.05
3 讨论
侵袭转移是肿瘤重要的生物学特征，也是肿瘤治疗中面临的最大的难题和防治重点。Liotta等[3]提出恶性肿瘤侵袭的三步学说，第一步细胞与细胞外基质(ECM)粘附；第二步肿瘤细胞本身或诱导宿主细胞分泌蛋白水解酶降解基质；最后一步即趋化介导的细胞运动和迁移。
近年来研究发现，COX-2在多种消化道肿瘤中过表达[4、5]，且与肝细臌癌的发生、发展和预后关系密切。Koga[6]等检测44例手术切除的HCC组织与癌旁非癌组织及7例正常肝组织中COX-2的表达，结果发现高分化的HCC较低分化的HCC或癌旁非癌组织COX-2的表达明显增强，癌旁非癌组织肝细胞中COX-2呈散在强表达，正常肝组织COX-2呈弱阳性表达。Kondo等[7]研究发现，HCC患者手术切除后,残留肝组织中COX-2高表达会促使癌细胞更易发生微转移而使其得以生存和扩散,导致肝癌的复发，提示HCC的预后差，可能与COX-2的高表达有关。Abiru等[8]发现肝细胞生长因子(HGF)可以通过促进肿瘤侵袭而加速肝癌细胞转移，应用阿司匹林或NS-398，一种特异性COX-2抑制剂，却可以消除HGF对HepG2的这种作用而不影响细胞的生存能力。这些研究结果为选择性COX-2抑制剂应用于肝癌的防治提供了理论依据。
本研究黏附实验表明，实验各剂量组塞来昔布对肝癌细胞与FN黏附率与对照组比较，差异具有显著性意义，说明塞来昔布能抑制SMMC-7721细胞黏附。此外，在肿瘤侵袭与转移的过程中，肿瘤细胞必须穿过血管、淋巴管的基底膜才能进入血管和淋巴管。达到转移的目的。因此癌细胞受趋化因素趋化并穿过基底膜的能力是侵袭和转移的关键因素之一。我们采用NIH／3T3上清作为趋化因素，Matrigel作为人工基底膜构建Boyden侵袭小室，肿瘤细胞黏附于人工基底膜后，消化降解基底膜并在趋化因素诱导下穿过基底膜，最后附着在滤膜另一面。从而通过计数细胞数反映细胞侵袭能力。本研究表明塞来昔布对SMMC-7721细胞侵袭、运动均具有抑制作用。
从以上实验结果我们可以看到塞来昔布对SMMC-7721细胞的黏附、运动、侵袭能力均有明显的抑制作用，从而阻抑肿瘤细胞的转移，为临床上塞来昔布防治肝癌的转移提供了理论依据。
参考文献：
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